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    原核蛋白表達攻略

    來源:admin  瀏覽量:  更新時間:2016-10-26 15:22:11

    原核蛋白表達一般以大腸桿菌為宿主細胞,具有繁殖快、表達量高、穩定性好、純化方便、抗污染能力強和成本低等有點,原核蛋白表達系統雖然是目前蛋白表達實驗中最常用、最經濟實惠的表達系統,但也同樣存在著一些困難。比如要表達的基因編碼區密碼子使用偏好或載體上調控元件與宿主菌不相容,導致目的蛋白無法表達或表達量低,有些雖然表達成功但目的蛋白不可溶等一系列問題。

       表達——純化是一個完整的、密切聯系的過程,純化過程中要保證所有試劑的足夠干凈,以免造成柱子堵塞,實驗進行不下去。超聲波破菌時要保證在低溫中進行,設置合適的超聲時間、超聲間歇時間、功率及探頭溫度,以免產生的熱量使蛋白降解,當菌液變得清透不粘稠時可視為破菌完全。過Ni柱時要盡可能的放慢流速,且保持用同一流速,不要忽快忽慢,防止蛋白聚集成沉淀,造成蛋白洗脫不下來。在漂洗蛋白過程中,要不斷的調整漂洗液與洗脫液的濃度,使雜蛋白很好的洗脫下來,而目的蛋白又不能被洗脫下來,保證目的蛋白的純度。對于不溶的蛋白也就是包涵體,要對其進行洗滌、變性、復性等處理。

    包涵體主要由蛋白質構成,其中大多數是基因表達的產物。這些結構不正確的基因表達出的蛋白不僅沒有生物活性,且不溶于水,所以包涵體表達的蛋白必須在變性劑溶液(如鹽酸胍、十二烷基肌氨酸鈉、尿素)中完全溶解,破壞所有的氫鍵和疏水鍵;再用洗滌液洗滌才能過Ni柱。


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