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    深度內含子變異的SCN1A小鼠模型揭示該基因毒外顯子異常調控在癲癇性腦病中的作用機制

    來源:admin  瀏覽量:  更新時間:2021-04-20 16:33:11

       Dravet綜合征(DS)是一種發育性癲癇性腦?。―EE),其特點難治性癲癇發作、發育遲緩、語言障礙、共濟失調、低張力、睡眠障礙和其他健康問題。編碼電壓門控鈉離子通道(Nav1.1)SCN1A的功能缺失突變是引起DS最常見的原因。只有80%的DS患者在SCN1A外顯子區檢測到致病性變異,這表明SCN1A內含子區的變異可能導致某些DS患者的疾病發生。針對640名DEE患者的基因組分析發現,在五名患者發現了SCN1A 20號內含子深處高度保守區域內的罕見變異,導致此區域內一段64 bp片段(20N)可以選擇性剪接進SCN1A的mRNA里。先前關于DS患者內含子變異和毒外顯子的研究是在人工構建的非神經元培養細胞中進行的,不能準確反應生物體內毒外顯子產生與DS表型關系,因此本研究通過對導致20N產生的SCN1A內含子變異小鼠模型的構建和分析,為內含子變異與DS發生提供了嚴格的因果關系證據,直接檢測體內毒外顯子的轉錄情況,并為鈉離子通道基因毒外顯子的功能及其與人類遺傳疾病的關系提供新的見解。該項研究2021年1月7日發表在學術期刊PLOS Genetics上,題目為《Aberrant regulation of a poison exon caused by a non-coding variant in a mouse model of Scn1a-associated epileptic encephalopathy》。



    研究結果:20N及側翼區域在進化上高度保守

      多物種的序列比對結果表明SCN1A 20N及其側翼區域高度保守,這提示該區域的變異可能影響Nav1.1的正常生物學功能。當20N及其側翼序列發生變異時會導致一段64nt的序列被異常剪接進SCN1A 轉錄本中形成外顯子20N,20N位于連接第三個SCN1A同源結構域D3的第四和第五跨膜電壓敏感區的胞內環中,20N的滯留引入了一個提前終止密碼子,這可能導致無義介導的mRNA降解(圖1)。本研究針對Carvil等2018年報道的引起20N產生的變異SCN1A_c.4002+2451G>C,使用CRISPR/Cas9基因編輯技術在小鼠中獲得相同位點c.3969+2451G>C的突變,并將攜帶該變異的小鼠稱為SCN1A+/KI以用于后續研究。



    圖1  20N及其側翼區域在不同物種間高度保守


    20N導致NMD發生并引起小鼠DS

      對SCN1A+/KI新出生小鼠腦組織中SCN1A轉錄水平和蛋白表達水平的檢測發現c.3969+2451G>C變異導致小鼠腦組織中SCN1A的轉錄水平下降為野生型小鼠的50%,針對Nav1.1的蛋白質印跡試驗也表明SCN1A+/KI小鼠中全長Nav1.1蛋白(260KD)的積累量下降為野生型小鼠的一半(圖2)。有趣的是在SCN1A+/KI小鼠中并未檢測到截短蛋白(157KD)的產生,因此c.3969+2451G>C變異導致Nav1.1的降低是由于含有20N的轉錄本發生無義介導的mRNA降解。


    圖2 SCN1A+/KI小鼠腦組織中SCN1A 轉錄本和Nav1.1蛋白水平降低

       與野生型小鼠相比,SCN1A+/KI小鼠的預期壽命顯著縮短。與其他DS成年小鼠的表型一致,SCN1A+/KI小鼠表現出過度活躍現象,在開放領域的行走距離和垂直跳躍次數均顯著高于野生型小鼠。與野生型小鼠相比,SCN1A+/KI小鼠在開闊視野中心的時間百分比和刻板印象計數相似,均沒有明顯的焦慮增加跡象(圖3)。綜合小鼠模型的分子生物學檢測結果和表型觀測結果,證實了毒外顯子20N導致小鼠DS的發生。


    圖3 SCN1A+/KI小鼠表現出壽命縮短和多動癥表型

    20N特異性的在小鼠腦組織中表達并隨發育進程逐漸降低

      在SCN1A+/KI成年小鼠的腦組織中SCN1A的轉錄本有4.8%是包含20N的,而在野生型成年小鼠腦組織中這一比例僅為0.97%(圖4)。而在腦組織的中,SCN1A+/KI小鼠的SCN1A表達量僅為野生型小鼠的50%,這意味著幾乎所有的包含20N的轉錄本會被降解,不翻譯成截短的蛋白。



    圖4 SCN1A+/KI 小鼠腦組織中20N的表達量增加


      SCN1A正常轉錄本在小鼠肺、肝、心臟和腎臟中均有低水平的表達,而在腦組織中表達量最高,20N在野生型小鼠肺、肝、心臟中不表達,在腎臟中僅有非常低水平的表達,在腦組織中表達水平的較高但是低于正常轉錄本的表達量。而在SCN1A+/KI小鼠的肺、腎臟和心臟中均可檢測到20N的表達,在腦組織中的表達水平亦高于野生型小鼠,但在腦組織中SCN1A正常轉錄本的表達量則低于野生型小鼠。


       通過對已公布的非20N變異小鼠皮層多個發育節點的轉錄組測序數據集來分析小鼠腦組織中20N和正常轉錄本的表達量,發現小鼠胚胎發育14.5天時,20N在腦組織中表達量最高,包含20N的轉錄本占SCN1A所有轉錄本的比例高達70%,隨后20N的表達量逐漸降低至出生后30天時20N占比<10%并維持這一水平至成年(圖5)。隨著異常剪接導致的20N的減少,更多正常剪接形式的SCN1A轉錄本產生。


       這意味著包含毒外顯子20N的異常剪接不是偶發事件,而是一種在胚胎早期發育過程中抑制SCN1A表達的主動調控過程。導致毒外顯子產生的變異維持了SCN1A的胚胎調控模式,包含20N的轉錄本持續產生,導致了新生兒SCN1A相關疾病的發生。SCN8A毒外顯子18N的表達模式與SCN1A 20N表達模式高度一致,這意味著毒外顯子主動調控模式可能是調控神經發育基因精準表達的一個共同特征。



    圖5 小鼠腦發育過程中鈉離子通道基因毒外顯子的表達


    討 論

       綜合本研究與先前關于Nav1.1和Nav1.6的細胞特異性和細胞區域類型特異性的表達研究結果,毒外顯子是一種正常且精確的調控模式,可以確保調控神經系統發育基因的時空精準表達,并為SCN1A或SCN8A變異導致臨床特征出現的時間提供了一種解釋機制。這種機制在進化上是保守的,代表了一種未被認識的孟德爾病的潛在來源。


       在胚胎發育早期,多達70%的SCN1A轉錄本包含毒外顯子20N,隨著時間的推移這些轉錄本在出生后減少到10%,這是胚胎早期發育過程中抑制SCN1A表達的主動調控過程。在正常發育過程中,包含20N的轉錄本在出生后逐漸減少,SCN1A的表達從毒外顯子介導的抑制中解除,編碼功能蛋白的SCN1A轉錄本迅速增加。導致毒外顯子產生的SCN1A內含子變異不會產生一種全新的正常轉錄,而是維持了SCN1A的胚胎調控模式,即“持續毒外顯子產生”(圖6)。這種由于內含子變異引起的持續的毒外顯子產生導致了SCN1A正常轉錄本的達量下降,具有完整生物學功能Nav1.1合成不足從而導致SCN1A相關疾病的發生。



    圖6  SCN1A 20N轉錄本表達量隨發育進程逐漸降低


       單倍劑量不足是DS的疾病機制,兩項發現徹底改變了目前對SCN1A相關疾病的認識:在Dravet綜合征患者中發現SCN1A高度保守內含子區域的變異導致毒外顯子20N的增加; 另一項發現是正常生物體內存在的非功能性的SCN1A 20N異常剪切事件可以通過專門設計的反義寡核苷酸(ASO)減少。這種機制可以在治療上加以利用,一種針對異常剪接轉錄本的新的治療方法即靶向提高該基因表達(Targeted Augmentation of Nuclear Gene Output,TANGO)的方法,在DS小鼠模型中恢復了SCN1A的表達量,減少了癲癇發作和癲癇猝死,這項新技術目前正走向臨床試驗。


       在所有人類基因中,有高達30%的基因轉錄毒外顯子,這似乎是生物體的一種正常調控機制,毒外顯子在1200多個與人類疾病相關的基因中也被發現,包括發育性和癲癇性腦?。―EE)的已知基因,如SYNGAP1、SCN2A、SCN8A等。這意味著毒外顯子在癲癇基因中很常見,是潛在的治療靶點。通過動物模型的研究,可以更加深入的探究毒外顯子與孟德爾病相關性的,更好地理解疾病的分子發病機制并對疾病治療靶點的發現和新藥物的開發至關重要。




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