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    做Western blot你肯定出現過這些問題

    來源:admin  瀏覽量:  更新時間:2019-11-15 17:13:55

        膜不是一片黑就是一片白,明明目的條帶只有一個,可是每次跑蛋白都能跑出好幾條,有的離目的條帶比較遠相對好認,但有的離目的條帶特別近,如果正好此處沒有marker就更難認了,這里給小伙伴們盤點下這些究竟是什么原因造成的,方便大家找出自己的目的蛋白~ 
        目的條帶好多個1. 抗體特異性不夠這里注意查看抗體說明書,有的抗體可以識別同源性的蛋白,如果你的目的條帶只有其中一條,可以查看兩種蛋白相對分子量的大小從而確定位置,筆者所跑的這兩個蛋白,1的分子量是76,2的分子量是82,從而可以確定上面的是2下面的是1。

        另外一種情況是識別磷酸化的蛋白的,為了更精準地確定目的蛋白的位置,可以再孵一下總蛋白。以筆者常做的一個蛋白GSK3β舉例:先看抗體:

        再看應用部分就可知這個抗體既可以識別GSK3α在Tyr279的磷酸化,也能識別GSK3β在Tyr216位的磷酸化,抗體孵育結果如下,出來多條:

        為了確定目的蛋白,洗去抗體再孵總蛋白GSK3β,結果如下,從而可以確定pGSK3βTyr216的目的條帶是位于下面的那條。

        同種蛋白一種蛋白經過酶的剪切之后,抗體既能識別剪切前的也能識別剪切后的,但是這里需要注意了,雖然孵出了兩個蛋白,但這兩種目的蛋白的曝光條件可能不一樣,筆者所做的兩個蛋白,2min短曝顯示的是酶剪切前的蛋白,剪切后的蛋白曝光條件為10min長曝。

        二聚體/三聚體如果你的目的蛋白分子量是80kd左右,跑出來的一張膜上在150、200kd分子量的marker附近位置處也顯示有條帶,那么可能的原因就是蛋白發生了二聚體/三聚體化。
        4. 前期(裂解、提取、煮蛋白等)操作不當導致蛋白降解或部分降解裂解時沒有加入足夠的蛋白酶或磷酸酶抑制劑、裂解后沒有及時放在冰上,長時間暴露于室溫下、煮蛋白不充分等等都可以導致蛋白降解,很典型的一個現象就是電泳、轉膜條件等都無誤的情況下膜上出現數條條帶且無法分辨目的蛋白,連內參也是這樣子,就只能重新提蛋白再做了。以下圖為例,可能的原因是蛋白降解了一部分,未降解部分仍然可以和抗體結合就導致了多條帶的發生。

        如果內參條帶十分好看,就只有目的蛋白出現這種情況,在排除抗體的原因后可能是裂解液出現了問題,可嘗試著更換裂解液。
        5. 目的蛋白就是這么多條帶不要總懷疑自己,跑出了好多條帶,自己也懵了,沒關系,可能目的蛋白就是這么多,如果少了反而不正確了,給大家看一個例子:

        6. 是目的蛋白,但位置稍有變動舉個栗子,過表達一個蛋白,這個外源性的蛋白帶有熒光基團或Flag,因為有了這些的“重量”,目的條帶出來時會比內源性表達的位置稍微靠上。
        我們再來說說有marker但膜一片黑的情況1. 抗體原因一抗、二抗都有可能,如果使用同樣的二抗別的蛋白可以出來那就是一抗的鍋了,看看你的抗體是否已經過期失效了,保存抗體的條件是否適合,購買渠道是否值得可信。這里給大家提個醒,筆者在實驗室一抗都是回收用的,注意回收的也不能一直用,用幾次就要換新抗體。
        2. 洗膜洗膜時間不夠,出現一片黑的情況時可以嘗試延長洗膜時間,當然了,這里也要注意洗膜液是否新鮮未變質,如果洗膜液出現問題,蛋白也是要受到影響的。
        3. PVDF
        PVDF膜大概是我們特別容易忽略的一個關鍵因素。但是筆者遇到過,之前實驗室買的便宜的膜不管孵什么蛋白背景都是黑黑的,后來查了很久才知道是PVDF膜的原因。(便宜的貨慎用)
        4. 蛋白樣品
        膜上一片白1. marker也沒有,最有可能的原因就是蛋白根本沒轉上,警告大家千萬別把轉膜的插頭插反,紅對紅黑對黑,這是筆者血淚的教訓。還有可能插頭正負極正確,但是轉膜時間過短。2. marker,看看抗體有沒有孵對,是不是剪膜的時候把目的條帶剪去了,抗體有沒有失效,二抗的種屬對不對,再去確認抗體孵育的時間和條件。
        膜上有蛋白的影子但是沒有條帶1. 還是抗體原因;2. 蛋白本身表達量很少,可嘗試增加蛋白樣品的濃度或上樣量;3. 轉膜時有氣泡;4. 蛋白前期降解,如果是磷酸化的看看裂解時有沒有加入足夠的磷酸酶抑制劑;5. 以上需要對比內參來分析。6. 轉膜條件不合適,或者使用的膜孔徑大小不合適。分子量比較小的蛋白一般選擇孔徑較小的膜。

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