• <xmp id="owc24">
    <input id="owc24"><object id="owc24"></object></input>
  • <tt id="owc24"><optgroup id="owc24"></optgroup></tt>
  • 項目查詢系統 用戶名: 密碼: 登錄 注冊

    DNA損傷檢測—彗星試驗

    來源:admin  瀏覽量:  更新時間:2019-08-01 09:33:04

    簡介

        單細胞凝膠電泳技術(Single cell gel electrophoresis, SCGE),又稱彗星試驗(Comet assay),是一種在單細胞水平檢測有核細胞DNA斷裂的新技術。此技術已經被廣泛應用于放射生物學、DNA斷裂與修復、毒理學、腫瘤治療評價、細胞凋亡等領域的研究。


    原理

        細胞核中的DNA為負超螺旋結構,而且很致密,通常DNA雙鏈以組蛋白為核心,盤旋而形成核小體。一般情況下,偶然的DNA單鏈斷裂對核酸分子雙股結構的連續性影響不大,而且不易釋放出來,但是,如果用去污劑破壞細胞膜和核膜,用高濃度鹽提取組蛋白,DNA殘留而形成類核。如果類核中的DNA有斷裂,斷裂點將引起DNA致密的超螺旋結構松散,在類核外形成一個DNA暈圈。將類核置于電場中電泳,DNA斷片可從類核部位向陽極遷移,經熒光染色后,在陽極方向可見形似彗星的特征性圖像,故稱“彗星試驗”。彗星尾部即為遷移出類核的DNA片段。此時彗星尾部有可能還與頭部以單鏈或雙鏈的形式相連。DNA損傷越嚴重,導致DNA超螺旋結構越松散,產生的斷裂點越多,DNA片段越小,從而在彗星尾部出現的DNA斷片越多,則慧尾的長度、面積和熒光強度越大。通過測量彗星尾部的長度、面積或熒光強度等指標,可以對DNA的損傷程度進行定量分析。


    實驗步驟

        1.溶液配制:

        0.75%低熔點膠:0.075 g低熔點膠溶于10 ml PBS中,微波爐加熱充分溶解,現配現用。

        0.75%正常熔點膠:0.75 g正常熔點膠溶于100 ml PBS中,微波爐加熱充分溶解,干燥條件下保存。

        彗星電泳裂解液:146.1 g NaCl,37.2 g Na2EDTA·2H2O,1.2 g Tris,加水至990 ml,調節pH至10.0,完全溶解后室溫保存,使用前加1% Triton X-100,應用液提前30 min配制并置于-4℃,現配現用。

        彗星電泳解旋與電泳液:200 g NaOH溶于500 ml雙蒸水,配制10 N NaOH溶液。14.89 g Na2EDTA溶于200 ml雙蒸水,配制200 mM Na2EDTA溶液。30 ml NaOH,5 ml Na2EDTA,定容至1 L,配制成解旋與電泳液,室溫保存,一周內使用完。

        2.取對數生長期的細胞,將密度調整約為1×105個/ml,以每孔2 ml接種至6孔板中,5% CO2、37℃恒溫培養箱中孵育過夜。當細胞貼壁50%-60%時,加藥處理細胞,繼續培養24 h后進行彗星試驗。收集細胞沉淀,用PBS洗兩次,用300 μl的PBS重懸細胞沉淀作為細胞樣品,待做彗星試驗。

        3.處理玻片:將載玻片提前在強酸溶液中浸泡過夜,用自來水反復沖洗,再用雙蒸水沖洗3-5次。最后用95%酒精浸泡,減少脫膠,實驗前用酒精燈烘干備用。

        4.膠的配制與鋪設:第一層膠用0.75%的正常熔點膠(NMAP)(膠用PBS溶解)200 μl鋪在玻片上,4℃放置使其凝固;第二層膠將0.75%的低熔點膠(LMAP)225 μl和75μl細胞樣品在37℃混勻,鋪在第一層膠板上,置于4℃條件下10min使其凝固;第三層膠將200 μl的0.75%低熔點膠鋪在第二層膠板上,置于4℃條件下10 min使其凝固。用鉛筆(防止標記被洗掉)在玻片上做好標記。

        5.裂解:將處理過的載玻片置于新配置的裂解液應用液中,在冰箱中于4℃避光裂解1.5 h。裂解液應用液現配現用,提前半小時配制置于4℃預冷,裂解液應用液使用時一定要透明,如果有結晶可加熱至透明。

        6.解旋與電泳:取出玻片,用雙蒸水漂洗2次,置于1X電泳液中4 oC避光解旋20 min,隨后在電泳槽內25 V電泳15 min。

        7.中和:電泳結束后用雙蒸水漂洗1次,洗掉多余的電泳溶液,然后將載玻片放在吸水紙上以吸收多余的水分,置于中和液(0.4M Tris·HCl,pH = 7.5)中浸洗5 min。中和后容易著色。

        8.染色和觀察:將2 μg/ml溴化乙錠(EB)滴在玻片上,每張玻片約250 μl染液,避光染色20 min。染色后洗去多余染液,吸去多余水分,用熒光顯微鏡(激發波長515-560 nm,綠光)觀察并拍照。圓形熒光核心表示未發生DNA損傷的細胞,即彗星頭部,無彗星尾部。有彗尾伸向陽極即使受損細胞,并且形成一個亮的彗星頭部和彗星尾部。

        9.用CASP彗星電泳處理軟件處理實驗圖片。



    服務內容

        樣本進行彗星試驗檢測DNA損傷,用CASP軟件處理圖片。


    服務價格與周期


    服務承諾

        提供完整的實驗操作步驟、彗星試驗結果圖片、CASP軟件處理結果、數據統計分析。


    樣品要求

         1. 細胞:客戶需提供狀態良好的細胞;如需使用本實驗室的自有細胞株,按500元/株收費;如需另外引種,按實際引種價格收費。
            藥物:客戶提供檢測藥物及加藥濃度。

       2培養細胞樣本:通過細胞計數取不少于2×106個細胞于EP管,加入0.5ml生理鹽水或蛋白保護劑,混勻后保存于冰箱(-80℃,避免反復凍融);

       3. 血液細胞標本:以抗凝管保存血樣或以淋巴細胞分離液分離細胞后加入0.5ml生理鹽水或蛋白保護劑,保存(-80℃可長期保存,避免反復凍融);

       4. 組織樣品:新鮮組織放入液氮或-80度保存,組織不少于100mg;

       5. 樣本運輸:可選擇以下任何一種方式寄送標本

          組織樣本、細胞樣本以干冰運輸或加入蛋白保護劑后,加冰袋寄送;

          細胞樣本也可直接寄送培養瓶(密封保證不污染、培養液不漏出);


    咨詢詳情請聯系

    TEL:027-87003398 19871486783

    QQ:1968663634(售前/售后) 1204661528(細胞)

    Email:service@bioeagle.com


    電話:027-87003398

    客服QQ:1968663631

    Email:service@bioeagle.com

    ICP備案號鄂ICP備14014009號-1

    在線咨詢
    在線咨詢 ×關閉
    在線咨詢
  • <xmp id="owc24">
    <input id="owc24"><object id="owc24"></object></input>
  • <tt id="owc24"><optgroup id="owc24"></optgroup></tt>
  • 亚洲av日韩精品久久久久久_亚洲成在人网站天堂日本_少妇xxxxx老师_国产下药迷倒白嫩美女网站