• <xmp id="owc24">
    <input id="owc24"><object id="owc24"></object></input>
  • <tt id="owc24"><optgroup id="owc24"></optgroup></tt>
  • 項目查詢系統 用戶名: 密碼: 登錄 注冊

    凝膠遷移實驗(EMSA)知多少

    來源:admin  瀏覽量:  更新時間:2019-05-06 17:19:44

    一、探討核酸與蛋白的相互作用

        電泳遷移率轉移法(EMSA)是一種檢測核酸蛋白復合物特異性結合的有效方法。 在過去的30年里,EMSA一直是研究核酸(DNARNA)與核酸結合蛋白之間定性相互作用的“檢測手段”。通過使用放射性標記探針,可以比較信號在聚丙烯酰胺凝膠上的位置,從而確定定性的相互作用。 此外,隨著計算機和光學成像技術的新進展,EMSA已經從單純的定性分析轉變為定量分析。

     

    二、加深對EMSA的理解 

        凝膠電泳是一種常用的根據分子量分離一組核酸或蛋白質的方法。 通常,瓊脂糖凝膠用于運行核酸,聚丙烯酰胺凝膠常用于蛋白質的分離。 EMSA利用了凝膠電泳中,在電場均勻的情況下,大型核酸蛋白復合物的遷移速度要比單一蛋白慢得多(如下圖)。 為了解釋這一點,我們來看看蛋白質的遷移。假設蛋白質x是一個基本單位(單體),它能夠與其他蛋白質x結合形成一個更大的復合物,稱為四聚體。 在相同電場下,四聚體在凝膠電泳實驗中總是比單體運行得慢得多。

     

    1:陰性對照(DNA),第2:蛋白質+不結合的DNA,第3:陽性對照。

     

        如果將同樣的原理應用于DNA結合蛋白,如果存在特定的DNA -蛋白復合物,那么凝膠電泳后的帶遷移將發生變化。 DNA-蛋白復合物的帶遷移通常用放射性標記的DNA探針來檢測序列特異性相互作用,這些探測通常由正在檢測的結合序列的線性延伸組成。 可以選擇在線性探針的前端(5 ')或后部(3 ')-端標記放射性同位素,如磷酸鹽-32 (32P)。 電泳后,凝膠通過x射線膠片顯示出來。 為了更加確定特定的蛋白是否與DNA結合,研究人員還可以在復合物中添加針對核酸結合蛋白的單克隆抗體,導致“凝膠超移位”。 研究蛋白質- DNA相互作用有多種方法。 例如,如果你想描述DNA-蛋白復合物的特征,可以使用免疫沉淀(DNA下拉),這涉及到使用帶有磁珠標記的抗體。 樣品可以通過磁性柱純化(下拉)。 此外,一種更專業的染色質免疫沉淀分析(ChIP)有時可以代替EMSA。

     

    三、核酸-蛋白質檢測方法的進階歷程

     

    ===檢測方法的類型===

    01放射性探針與熒光染料探針

        如上所述,傳統的EMSA檢測是使用放射性標記的核酸探針。 雖然凝膠轉移法的原理沒有改變,新的檢測試劑不斷開發。現在,我們需要遠離可能傷害我們自己和污染我們環境的放射性物質。

    可替代的,研究人員使用熒光染料或熒光素發光系統,這些新系統不僅在健康和環境方面更安全,而且比放射性裝置更精確,往往產生更少的背景噪音。要使用熒光探針,需要一種具有激發光源的光學圖像采集系統。通常,這些成像設備由兩部分組成:

        1)控制圖像聚焦和曝光的數碼相機系統;

        2)廣譜光源(從紫外線到不同激發波長的激光器),以配合市場上不同種類的熒光染料。采用適當的技術,可以獲得良好的成像效果。


    02化學發光EMSA

        通常,這類試劑盒提供生物素標記的受控DNA和核提取控制設備,供您標準化您的實驗。 使用合適的檢測設備,化學發光反應會發出清晰而強烈的信號。 輕微的缺點是,需要對DNA模板(目標)進行生物素化,但通常也可以從商業來源定制DNA寡核苷酸。

     

    03SYBR綠色核染色&紅色蛋白染色

        一些實驗室已經成功地使用了EMSA的商用試劑盒,這些試劑盒被設計用來根據顏色分離核酸和蛋白質。 核酸染成綠色,蛋白質染成紅色。因此,當兩者形成復合物時,最終顏色將是黃色。同樣,可以在商業光學成像系統上可視化您的結果。 這是一種非常簡潔的快速檢測方法,特別是當標記目標核酸不是最佳選擇時。

     

    ===檢測的其它方法===

    01快速瓊脂糖凝膠電泳

        由Lewis KA領導的一個研究小組開發了一種使用瓊脂糖凝膠的新方法。 該方法比傳統SDS-PAGE使用的聚丙烯酰胺更容易制備和表現。 此外,該組能夠通過在高電壓下運行來減少運行時間并仍然獲得高分辨率數據。 但通常,增加電壓可能導致拖尾效應。

     

    02微流體與96孔板微陣列

        還有一些更專業的檢測方法。 例如,NF-kB檢測試劑盒使用固定的靶序列DNA進行高通量篩選。 它適用于96孔板形式,可以添加樣品核提取物,使用能夠檢測核DNA復合物的單克隆抗體檢測陽性結果。另一種潛在的高通量方法使用微流體芯片,設計用于分離不同大小的DNA片段。 由Smith等人領導的研究小組報道,DNA-蛋白質復合物也可以使用這些微流體裝置分離。 EMSADNA-蛋白質相互作用方面具有廣泛的應用,并且仍在添加和修改不同的檢測方法。

     

    電話:027-87003398

    客服QQ:1968663631

    Email:service@bioeagle.com

    ICP備案號鄂ICP備14014009號-1

    在線咨詢
    在線咨詢 ×關閉
    在線咨詢
  • <xmp id="owc24">
    <input id="owc24"><object id="owc24"></object></input>
  • <tt id="owc24"><optgroup id="owc24"></optgroup></tt>
  • 亚洲av日韩精品久久久久久_亚洲成在人网站天堂日本_少妇xxxxx老师_国产下药迷倒白嫩美女网站