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    Western Blot(蛋白質印跡法/免疫印跡試驗)

    來源:admin  瀏覽量:  更新時間:2019-04-23 10:22:33

    原理采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),被檢測物是蛋白質,"探針"是抗體,"顯色"用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品,轉移到固相載體(例如聚偏二氯乙烯膜-PVDF)上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質,且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原,與對應的抗體起免疫反應,再與酶或同位素標記的第二抗體起反應,經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。

     

    步驟提取蛋白樣品---蛋白定量---蛋白樣品變性處理---PAGE膠的配制---蛋白凝膠電泳( 冷卻到室溫后,把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內即可)---轉膜---封閉---抗體孵育---顯影

     

    1. 提取蛋白樣品(冰上進行):視細胞的體積而定,加入100-200 ul細胞裂解液,裂解30 min,期間每5min混勻一次,4 -12000 rpm離心10-15min,取上清,保存于-80度。

     

    2. 蛋白定量:采用翊圣的BCA蛋白濃度測定試劑盒,微孔板檢測方法。(配標品---稀釋樣品---BCA工作液---分裝、震蕩、離心,37 孵育30 min---OD540nm處)---做標曲---計算濃度。具體操作方法見說明書)

     

    3. 蛋白樣品變性處理:計算好樣品體系后(細胞裂解液+5*lodding buffer+蛋白樣),震蕩離心,封口膜封口,100 水浴加熱10 min,冰浴5min,離心后點樣,或-20度保存。

     

    4. 配備蛋白-PAGE:小分子量的蛋白,我們選取的是12%的下層膠和5%的上層膠。具體的體系見說明書。(注意TMED促凝劑最后再加。體系混勻以后立刻加入制膠板,下層膠加完之后,立刻用1 ml乙醇封,封的時候,乙醇流速要緩慢,以免沖出坑。待下層膠凝固以后1-1.5h,倒掉乙醇,待乙醇揮發干凈以后,加入上層膠。上下層膠的凝固時間為1-1.5h左右。

     

    5. 蛋白凝膠電泳(恒壓)點樣過程樣本濃度、體積必須保持一致,注意電極的正反向。 電泳時通常推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳(70-90V),而在溴酚藍進入下層膠時使用高電壓恒壓電泳(110-120V左右)。

     

    6. 轉膜(恒流)提前制冰和預冷轉膜buffer,轉膜buffer提前在4 預冷或者-20 預冷(不可超過2h,否則凍結),注意電極的正反向,以及海綿-濾紙-膠的順序。裁剪掉右上角的PVDF膜泡入甲醇中待用。裁剪掉右上角的蛋白膠、濾紙(完全浸濕)和海綿浸泡在轉膜緩沖液中,碾壓的目的在于一方面保證濾紙和PVDF膜以及蛋白膠之間無氣泡,一方面保證膠和膜貼近。



    7. 封閉(5%的脫脂牛奶,用1*TBST配備) 轉膜完畢后,立刻用1*TBST清洗一次,以洗去膜上的轉膜液,加入足量的5%脫脂牛奶,封閉90min。選用側擺搖床緩慢搖動封閉,側向擺動速度比較緩慢,而且也容易讓溶液覆蓋蛋白膜。(從轉膜完畢后所有的步驟,一定要注意膜的保濕,避免膜的干燥,否則極易產生較高的背景。)

     

    8. 一抗孵育(一抗 3 ml,一般可以重復使用多次,只要沒有被污染,因此一抗要回收。)
          參考一抗的說明書,按照適當比例用Western一抗稀釋液CAS-Block稀釋一抗(不可以用牛奶,因為牛奶保存過久會變質)。 
          可以4緩慢搖動孵育過夜?;蚋鶕贵w的說明選擇適當的孵育溫度和時間。
          回收一抗。加入1*TBST,在側擺搖床上緩慢洗滌3-4,每次洗滌5分鐘。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。

     

    9. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) (二抗僅使用一次,加入4-5 ml
          參考二抗的說明書,按照適當比例用5%的脫脂奶粉稀釋二抗(通常1:20000)。 二抗需根據一抗進行選擇,例如,一抗是小鼠來源的IgG,則二抗需選擇抗小鼠IgG的二抗,倒掉洗滌液后(洗滌液不用吸得特別干凈,因為一方面要保持膜的濕潤,另一方面5%的脫脂奶粉是用1*TBST稀釋的),立即加入稀釋好的二抗,室溫在側擺搖床上緩慢搖動孵育1.5小時。 
          1*TBST進行洗滌,在側擺搖床上緩慢搖動洗滌3-4,每次洗滌5分鐘。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。

     

    10. 顯影定影液千萬不可以滴到顯影液中,否則顯影液即刻失效。顯影的過程中可以調節的便是壓片時間和顯影時間,膠片一定必須要避光。膠片拿出后,及時封閉膠片盒,開燈之前一定要檢查膠片盒是否已封好。




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