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    熒光定量PCR(qPCR)技術概述

    來源:admin  瀏覽量:  更新時間:2018-07-24 14:23:07

    一、qPCR概述——“做的就是專業”:
      基本原理不必贅述?。?!方法學上可分為兩類:染料法(下左圖)和探針法(下右圖)。幾乎每個實驗室/平臺都配備了qPCR儀,幾乎每位研究生也都會說“我會做qPCR”,但你真的會做嗎,計算的結果可靠嗎,又是否可以靈活應用呢?

        以下幾個問題如果你遇到過且解決不了,那你需要我們:1)每次實驗前對于幾個樣品幾對引物幾組重復,在計算Mix和加樣的時候都要瘋了? 2)RNA及cDNA的模版質量是否關注過并能區分好壞?以及OD值對于痕量樣本的參考意義?3)是否遇到過不同內參的檢測差異就很大,又該用哪個內參進行回歸計算呢? 4)熟悉染料法的你,是否了解什么情況下應該用探針法,以及引物和探針設計的技巧呢? 5)溶解曲線雙峰、雜峰的解讀? 6)復孔之間結果的差異辨別,以及孔板邊緣效應? 7)了解反應體系內是否應該含有內標,以及內標對于結果的影響嗎? 8)最后,會做標準曲線并能計算核酸絕對含量的人應該就少之又少了吧?



    二、服務優勢:

    1. Bio-Rad CFX96定量PCR系統,定期檢測、維護各孔的擴增表現。做到8點各18個復孔標曲R2>0.99,擴增效率滿足90%-110%。

    2. 實驗操作分區,避免檢測樣品交叉污染

    3. 模板及引物預實驗嚴格質控,NanoDrop檢測RNA樣品的濃度和純度,并結合瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量;等量RNA模版制備cDNA/miRNAs,等量cDNA/miRNAs模版進行qPCR檢測,最大限度做到條件一致。

    4. 免費提供內參基因檢測及引物預實驗條件。也可根據實驗特殊性進行多內參檢測和比較。

     

     

    三.服務內容:

    分類

    服務項目

    絕對熒光定量

    建立標準品標準曲線,檢測樣本中的目的基因,通過與標準曲線比對,得到檢測目的基因的準確拷貝數,可選SYBR染料法和Taqman探針法

    相對熒光定量

    免費提供內參基因,采用2-△△Ct法計算檢測目的基因的相對表達量,可選SYBR染料法和Taqman探針法

     

    1)多物種多樣品,總RNA提取,cDNA合成或成熟體miRNAs合成(加尾法);

    2)預實驗檢測cDNA/miRNAs模板及引物特異性;

    3)QPCR擴增曲線(三次技術重復避免系統誤差)、熔解曲線(檢測擴增質量),5-8點構建標準曲線;

    4)待測基因、miRs表達差異分析(相對定量);

    5)生物制劑、生物樣本中待測核酸殘留量檢測(絕對定量);

    6)SNP分型

    7)詳細的實驗報告(包含實驗使用的儀器試劑、實驗步驟及實驗結果)

     

    四.服務流程:

    五、送樣須知:

    本公司接受任何類型的樣本,對于不同的樣本最低需求量略有不同,具體要求如下描述,亦可電話咨詢。客戶還需提供其他詳細信息:如物種信息,待測基因的序列、GeneID、miRNA名稱等。

     

    1、組織樣品:不少于100mg,如組織塊較大,請盡可能剪碎,避免因整塊反復凍融導致樣品降解,然后浸泡在組織RNA保存液中,低溫寄送。

    2、細胞樣品:六孔板的1/樣80~90%融合度),PBS清洗、收集細胞、去上清后,加1ml Trizon重懸,短期低溫保存低溫運送;或細胞沉淀直接液氮速凍,-80℃可長期,干冰寄送,確保無凍融。

    3、痕量樣本(外泌體等):新鮮樣本即刻低溫運輸;長期保存的冷凍樣本,干冰寄送,無凍融,已能有效擴增內參為質檢合格。

    4、病毒樣品:不少于200ul病毒液;冰袋低溫寄送。

    5、細菌樣品1ml~1.5ml飽和菌液樣品;離心后去盡上清;液氮速凍,-80℃保存,干冰寄送,全程確定樣品無凍融。

    6、RNA樣品:干冰寄送。以本實驗室收到RNA樣本后的電泳檢測結果為準;如電泳檢測RNA質量不合格,需重新提供樣品。

    7、血液樣本:請將新鮮血液直接收集到“血液RNA保存管”中,混勻后即刻低溫運送,或低溫保存后干冰運輸。

     

    五、熒光定量PCR實驗服務報告內容:
    1、RNA濃度及純度檢測,引物、探針預實驗擴增效果及特異性檢測;

    2、 絕對定量:“標準品”載體構建、測序結果;

    3、qPCR原始數據、計算、分析結果;完整的實驗步驟、儀器參數、軟件設置等信息。

     

    六、實驗服務周期及收費標準:

    內容

    單價

    周期

    mRNA提取及cDNA合成

    100/樣品

    1~3

    miRNA提取及cDNA合成

    300/樣品

    1~3

    引物設計、合成

    40/

    2

    探針設計、合成

    800/

    7

    預實驗(檢測引物擴增效率)

    免費

    1~3

    qPCR檢測

    (免費檢測1內參)

    80/3個復孔/指標/樣品(染料)

    2-7

    100/3個復孔/指標/樣品(探針)

    100/3個復孔/指標/樣品miRNA,加尾法

    注:100個以上檢測指標(樣品數*基因數>100),折扣詳詢

    七、結果示例:

     

    例一 目的基因表達檢測,包含RNA電泳圖、引物特異性預實驗、擴增曲線、熔解曲線

     

    A. RNA電泳檢測圖                             B. 擴增曲線

        C.引物擴增及特異性預實驗檢測                 D. 熔解曲線


    例二miRNA表達檢測


    例三:絕對定量,5點稀釋梯度各18復孔標準曲線制作,R2值超過0.999





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