• <xmp id="owc24">
    <input id="owc24"><object id="owc24"></object></input>
  • <tt id="owc24"><optgroup id="owc24"></optgroup></tt>
  • 項目查詢系統 用戶名: 密碼: 登錄 注冊

    慢病毒包裝步驟及經驗總結

    來源:admin  瀏覽量:  更新時間:2017-09-06 17:34:22




    慢病毒(Lentivirus)是逆轉錄病毒的一種,它能夠將靶基因導入到一些較難轉染的細胞,如原代細胞等,并且將靶基因隨機整合到宿主的基因組中,從而大大增加了轉染效率,并且能夠在細胞系中穩定表達若干代,可以進行穩轉細胞株的篩選。因為是隨機整合,也有不確定因素,有些公司還能提供定點整合技術,將靶基因定點整合到基因組特定的部位,從而保證其高效表達并且對細胞不產生隨機整合可能產生的傷害。



        慢病毒表達載體包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質??商峁┧械霓D錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產生高滴度的病毒顆粒,需要利用表達載體和包裝質粒同時共轉染細胞,在細胞中進行病毒的包裝,包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中,離心取得上清液后,可以直接用于宿主細胞的感染。



       慢病毒載體基因組是正鏈RNA,其基因組進入細胞后,在細胞漿中被其自身攜帶的逆轉錄酶逆轉錄為DNA,形成DNA整合前復合體,進入細胞核后,DNA整合到細胞基因組中。整合后的DNA轉錄mRNA,回到細胞漿中,表達目的蛋白或產生RNAi干擾。



    慢病毒包裝系統由一個包裝質?;旌衔铮∕ix)和一個慢病毒載體質粒(LentiviralVector)組成,如下圖(圖片來自MIT):





    載體中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他輔助元件等。

    不同系統包裝質?;旌衔镆膊灰粯?,以本實驗室的三質粒系統為例,包裝質?;旌衔镏泻琾MDL,VSVG,pRSV-Rev,比例為5:3:2;其中pMDL含有編碼HIV病毒主要結構蛋白的gag基因和編碼病毒特異性酶的pol基因,pRSV-Rev含編碼調節gag和pol基因表達的調節因子rev基因,VSVG含有提供病毒包裝所需要的單純皰疹病毒來源的VSVG基因。





        以下介紹用293T細胞在六孔板(35mm)中包裝病毒,其他孔板相應增加或減少體積。




    準備
    試劑篇
    ? 核心質粒;
    ? 指數生長的293T細胞;
    ? 病毒包裝質粒Mix:1 μg/μl(Mix=pMDL: VSV-G : REV=5:3:2),不同載體系統所用的包裝病毒質粒也不一樣,此系統可用于包裝PBOBi,PLKO, Plv等載體質粒。
    ? 轉染試劑:turbofect, 也可以用其它的如lipo2000等。
    1
    細胞分盤




    通過胰酶消化收集細胞,用適當的完全培養基平鋪細胞于35mm 培養皿上根據實驗需要選擇培養皿,使細胞貼壁后所占面積達到培養皿總面積的80%以上。將細胞置于含5%CO2的37℃溫箱中孵育8-24h,當細胞貼壁完全后即可開始轉染。轉染前 2h 換液(用1.5ml完全培養基換舊的培養基)。




    2
    混勻核心質粒和包裝質粒




    取無菌1.5ml EP管,加入400μl 無血清DMEM,加入1.5μg 核心質粒和1.5μg 病毒包裝質粒,及6μl turbofect (turbofect :質粒=2:1),充分混勻,靜置15-20min。




    3
    孵育




    將這400μl 的混合液逐滴加入上述單層細胞的細胞培養基中,輕輕搖動平皿混勻后置于含5%CO2的37℃溫箱孵育。




    4
    收集病毒上清




    6-10 h后吸去培養基,加入2.5ml37℃預熱的完全培養基,繼續將細胞放置溫箱孵育,40h左右可以收集含慢病毒的上清進行感染或者分裝后置于-80℃儲存待用。(1500rpm離心5分鐘,一般可收集到2ml含病毒上清)


    5
    病毒感染




    1)將細胞平鋪于6孔板或12孔板,最佳密度為30%-70%。

    2)對于六孔板:(12孔板減半)

     Infectmouse cells:800-1600μl virus + 1600-800 μl fresh medium =2.4 ml total

     Infecthuman cells:200-800μl virus + 1200 μl-800 μl fresh medium =2 ml total

    3)加入2-5μg/ml polybrene, 充分搖勻后置于37℃溫箱孵育。

    4)12-24h 后換液,長滿后傳代或者檢測表達,做實驗。


    腺病毒 or 慢病毒?



    慢病毒可以插入細胞基因組,穩定表達,持續時間長。 包裝周期短(一般要兩個月),感染效率相對于腺病毒要低很多。不能擴增,一次包裝的病毒用完后如果再需要只能重新包裝。一次包裝所得到的的病毒滴度也相對較低(10 的 8 次方 pfu/ml),不大適合直接用于動物實驗。


    腺病毒感染效率高,很多細胞都能達到近 99%。純化后的腺病毒可以直接進行動物活體注射??梢栽隗w外擴增,每次使用完后,可以自己用包裝細胞進行擴增,節約成本。一次包裝所得到的滴度較高(純化后為 10 的 11 次方 pfu/ml,未純化的為 10 的 10 次方 pfu/ml)。不整合到基因組,無法穩定表達。表達時間相對于慢病毒較短(兩三周這樣)。包裝腺病毒的周期會比慢病毒長一些(一般要兩個半月),因為腺病毒包裝過程相對較繁瑣。



    病毒包裝的關鍵點



    病毒包裝的幾個關鍵節點就是細胞因素、載體系統 (盡量使用成熟的商業化載體系統)、構建重組的質粒正確與否、質粒抽提純化情況、包裝轉染控制 (24、48 小時的細胞及熒光狀態判斷)、目的基因對病毒包裝影響 (基因大小、序列情況、蛋白功能毒性等都會影響到是否能包裝成功)。


    如何提高病毒感染效率



    病毒感染效率主要和三方面有關,病毒本身的滴度,目的細胞種類以及個人操作問題。在這里我先把操作問題排除,你若想提高病毒感染效率,可以先提高病毒滴度,在感染的過程中適當的加大病毒感染量或者通過多次加入病毒提高感染率。其次,你也可以加一些輔助感染試劑來提高病毒感染率的,如 polybrene。另外,你要根據不同的目的細胞加入合適的病毒量,這樣才能更精確的提高病毒感染效率。


    293T 細胞有關



    293T 細胞長的比較快,傳代時也容易從壁上脫落,不需要怎么吹打,保險起見,在消化時還是要盡量吹打均勻。此外傳代時吹打的細胞液,每個平皿里的細胞也要鋪的均勻,并要及時換液傳代。


    293T 細胞包裝慢病毒時,轉染方法優先選擇陽離子脂質體方法。氯化鈣法轉染效率相對低,出毒效率相對低。且對氯化鈣法對 pH 值要求很苛刻,差一點都不行。陽離子脂質體法效果比較好,但常規使用的 Lipo2000 細胞毒性大,有錢的可以使用低毒性的 Fugene HD,錢少的可以選用其他公司的 Lipofiter 陽離子脂質體產品,效率和 Lipo2000 差不多,毒性基本沒有。


    病毒濃縮有關



    病毒一般可以收兩次,可以在 48 h 和 72 h 各收一次。如果你不想麻煩濃縮病毒的話,也可以不濃縮,直接將收集的病毒上清作為要感染的細胞的培養基,但是可能效果會不太好。并且一般收病毒時,培養基的營養已經損耗了很多,那樣直接培養感染細胞會損害細胞,所以建議還是進行濃縮后再感染。


    如何提高腺病毒的活性?



    提高腺病毒的活性,關鍵應該是在病毒包裝過程和擴增過程。純化過程只是去掉有缺陷的病毒和細胞碎片等容易引起機體免疫反應的過程,如果擴增的病毒滴度高,那么純化后就會更高的。


    純化后病毒如何保存?



    純化后的病毒用無血清的 DMEM 保存就可以了,一般放在 -80 度進行長久保存。如果收集的上清不想立即純化可先放在 -80 度,等下次收集的一起純化。目的蛋白在包裝細胞中或者滴度測定細胞中會表達的,滴度測定就是根據目的蛋白表達情況來進行操作的。

    電話:027-87003398

    客服QQ:1968663631

    Email:service@bioeagle.com

    ICP備案號鄂ICP備14014009號-1

    在線咨詢
    在線咨詢 ×關閉
    在線咨詢
  • <xmp id="owc24">
    <input id="owc24"><object id="owc24"></object></input>
  • <tt id="owc24"><optgroup id="owc24"></optgroup></tt>
  • 亚洲av日韩精品久久久久久_亚洲成在人网站天堂日本_少妇xxxxx老师_国产下药迷倒白嫩美女网站